藏羊是青藏高原特有的物種，生活在青海省的黃 南、果洛、玉樹、海北、海南、海西等高寒高海拔地區(qū)， 具有一定的抗寒抗病能力。巨噬細(xì)胞的移動抑制 因子( MIF) 最初作為 T 淋巴細(xì)胞的激活產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)， 因其在體外可以抑制巨噬細(xì)胞的移動而得名。胰 島 β 細(xì)胞通過分泌 MIF 來促進(jìn)胰島素的釋放，從而 影響血糖代謝。

1 材料

1. 1 試驗樣品

健康高原型藏羊脾臟組織，青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動 物醫(yī)學(xué)系預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室采集并冷凍保存。

1. 2 主要試劑

組織 ＲNA 提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科 技有 限 公 司; Prime Script 反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒、Premix TaqTM、DL－2 000 Marker，均購自寶生物工程( 大連) 有限公司。

1. 3 主要儀器

高速離心機(jī)( 型號為 SIGMA1 － 14) ，購自德國 Sigma 公司; PCＲ 儀( 型號為 T100) ，購自伯樂公司; 電子天平( 型號為 AL104) ，購自梅特勒－托利多儀器 有限公司; 生化培養(yǎng)箱( 型號為 LＲH－100CL) ，購自 上海一恒科技有限公司。

2 方法

2. 1 引物的設(shè)計與合成

根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫中登錄的綿羊參考序列，設(shè)計 藏羊 MIF 基因的 PCＲ 引物。引物序列( 登錄號為 DQ414692. 1) 為 MIF－F 5' －ATGCCGATGTTCGTGGTGAA－3'; MIF－Ｒ 5'－TCAGGCGAAGGTGGAGCC－3'。

2. 2 總 ＲNA 的提取

按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2. 3 ＲT－PCＲ 擴(kuò)增

反轉(zhuǎn)錄 cDNA: 取總 ＲNA 5 μL，下游引物 2 μL， dNTP Mixture 2 μL，ddH2O 1 μL，65 ℃ 恒 溫 水 浴 5 min，迅速于冰盒中冷卻 2 min; 加入 5×反轉(zhuǎn)錄緩沖 液 4 μL，ＲNA 酶 抑 制 劑 0. 5 μL，反 轉(zhuǎn) 錄 酶 1 μL， ddH2O 4. 5 μL，充分混勻，于 42 ℃ 溫箱中反應(yīng) 40 ～ 60 min，70 ℃水浴 15 min，冷卻后保存，備用。 PCＲ 擴(kuò)增體系: 預(yù)混液( PCＲ Buffer、dNTPs、DNA 聚合酶) 25 μL，cDNA 5 μL，上 下 游 引 物 各 1 μL， ddH2O 18 μL。PCＲ 擴(kuò)增 程 序: 94 ℃ 1 min，62 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán); 72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束 后－20 ℃保存，備用。

2. 4 核苷酸序列測定與分析

將瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的 PCＲ 擴(kuò)增產(chǎn)物送 至生物工程( 上海) 股份有限公司進(jìn)行測序，采用 DNAStar 軟件進(jìn)行 MIF 基因序列分析。

2. 5 蛋白質(zhì)特性分析

分別應(yīng)用 DNAStar、SignalP、TMHMM、I －Tasser、 Predictprotein 等軟件對 MIF 蛋白的二級結(jié)構(gòu)、親水 性、柔韌性、表面可及性、信號肽、跨膜螺旋區(qū)、修飾位 點等蛋白特性進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

藏羊 MIF 基因 ＲT－PCＲ 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠 電泳檢測，結(jié)果 MIF 基因所在泳道出現(xiàn)與預(yù)期大小 相符的目的基因條帶( 348 bp) 且條帶清晰，見圖 1。

將藏羊 MIF 基因與綿羊( 登錄 號 為 NM001033608. 1 ) 、 瘤 牛 ( 登 錄 號 為 XM019977119. 1) 、普通牛( 登錄號為 HF564807. 1) 、 水牛( 登錄號為 XM_006048115. 2) 和山羊( 登錄號: XM018060897. 1) 進(jìn)行同源比對，結(jié)果核苷酸同源性 依次為 100%、99. 7%、99. 7%、99. 4%和 100%，蛋白 氨基酸同源性皆為 100%。蛋白修飾位點分析結(jié)果顯示: 藏羊 MIF 蛋白含 有 2 個 N－糖基化位點，分別為 73 ～ 76 位的 NＲSY、 110 ～ 113 位的 NGST; 2 個蛋白激酶 C 位點，分別為 31 ～ 33 位的 TGK、85 ～ 87 位的 TEＲ; 1 個酪蛋白激酶 Ⅱ磷酸化位點，為 14 ～ 17 位的 SVPD; 1 個酪氨酸激 酶磷酸化位點，為 89 ～ 96 位的 ＲISPDＲIY; 1 個 N －肉 豆蔻?；稽c，為 69 ～ 74 位的 GGAQNＲ; MIF 家族為 55 ～ 69 位的 EPCALCSLHSIGKIG。

4 討論 

MIF 作為血管形成因子 既能促進(jìn)小鼠體內(nèi)微血管的形成，也能促進(jìn)人體新生 微血管的形成，這也提示藏羊 MIF 基因可能具有促 進(jìn)藏羊微血管形成的作用。MIF 在膿毒癥的發(fā)病機(jī) 制中起著不同作用: 一方面毒素、細(xì)菌等誘導(dǎo)巨噬細(xì) 胞、T 細(xì)胞等組織器官產(chǎn)生 MIF，發(fā)揮對病原菌的免 疫作用; 另一方面，高水平的 MIF 會加重膿毒癥的 器官損傷。趙喆等研究結(jié)果表明，當(dāng)小鼠處于 重物墜落時所致的脊髓損傷急性期時，MIF 在參與脊 髓損傷與修復(fù)過程中發(fā)揮重要的作用。此外，MIF 與 佐劑性關(guān)節(jié)炎、胃癌、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、乳 腺癌等的發(fā)生都有密切的關(guān)系。