半個(gè)世紀(jì)以來，心腦血管疾病已成為威脅人類健 康的首要疾病，其死亡率已超過所有癌癥的總和。流 行病學(xué)和臨床調(diào)查表明，高膽固醇是引發(fā)該疾病的重 要因素之一，降低血清膽固醇水平，特別是低密度脂 蛋白水平，能顯著降低該疾病的發(fā)病率和死亡率。 某些乳酸菌菌株，能夠促進(jìn)胃腸道吸收，增加腸道有 益菌群，改善人體胃腸道功能，抑制腐敗菌的繁殖，提 高機(jī)體免疫力等重要生理功能。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

酸菜汁液：采自黑龍江佳木斯市農(nóng)家發(fā)酵酸菜，采 集樣品于離心管內(nèi)，加入無菌甘油使終濃度為 25 %， 于-80 ℃冰箱保存。 MRS 培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；MRSCHOL 培養(yǎng)基：膽固醇 1.0 g，加 1 mL 吐溫-80 助溶， 加入 1 000 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，調(diào) pH 值至 7.0。 革蘭氏染色試劑盒、乳酸菌生化鑒定試劑盒：北 京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑 盒、引物、TE 緩沖液、DNA Marker 、ddH2O、Mix 液：天 根生化科技有限公司；牛膽鹽、膽固醇（99 %）：美國 sigma 公司；鄰苯二甲醛、氯化鈉、鹽酸、冰乙酸、正己 烷、無水乙醇、氫氧化鉀等試劑均為分析純級：國藥化 學(xué)試劑集團(tuán)。

1.2 主要設(shè)備及儀器

一恒DHP-9082 恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限 公司；HDL 超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；GL124-1SCN 萬分之一分析天平：賽多利斯科學(xué) 儀器（北京）有限公司；LDZX-50KB 立式壓力蒸汽滅火 器：上海申安醫(yī)療器械廠；PHS-3C 雷磁 pH 計(jì)：上海精 密科學(xué)儀器有限公司；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵： 上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CX41RF 顯微鏡：日本奧 林巴斯公司；TP600 梯度 PCR 儀：日本 TAKARA 公司； Sigma-3K15 離心機(jī)：德國 SIGMA 科技有限公司；UV2600 紫外可見分光光度計(jì)：島津儀器有限公司；DYY6C 電泳儀：北六一儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的初步分離純化

將帶回的酸菜汁液解凍，以備使用。采用梯度平 板稀釋法，吸取酸菜汁液于 0.85 %理鹽水中進(jìn)行梯度 稀釋，然后涂布于含 0.5 % CaCO3 的固體 MRS 培養(yǎng)基 上，37 ℃靜置培養(yǎng) 48 h，挑選平板上有明顯透明圈的 菌落，在 MRS 平板上多次劃線純化直至菌落形態(tài)單 一，挑取單菌落到 MRS 液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng) 24 h，記 錄菌落特征，于 4 ℃冰箱存儲備用。

1.3.2 生理生化鑒定試驗(yàn)

對菌株進(jìn)行革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗(yàn)、采用 乳酸菌生化鑒定試劑盒做碳水化合物（蔗糖、甘露醇、 山梨醇、水楊苷等）發(fā)酵試驗(yàn)。

1.3.3 菌種 16S rDNA 鑒定

試驗(yàn)采用細(xì)菌基因組 DNA 試劑盒提取細(xì)菌 DNA，利 用 引 物 27F （5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'）、 1492R （5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 進(jìn)行擴(kuò) 增；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 4 min；95 ℃變性 45 s，50 ℃退 火 45 s，72 ℃延伸 2 min，循環(huán) 30 次；72 ℃延伸 10 min， 4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1 %瓊脂糖電泳分析后，送交華 大基因公司進(jìn)行 16S rDNA 測序，所得序列在 NCBI 中 進(jìn)行比對，確定菌種。

1.3.4 降膽固醇乳酸菌的篩選

繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線：取 1 mL 的配制質(zhì)量濃度為 0.02、0.05、0.10、0.12、0.15、0.20 mg/mL 的 膽 固 醇 系 列 標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入 3 mL 95 %乙醇、2 mL 50 %氫氧化鉀， 旋渦振蕩混勻。于 60 ℃下恒溫水浴 10 min ，冷卻后加 入 5 mL 正己烷，旋渦振蕩萃取 1 min~2 min，加入 2 mL蒸餾水，振蕩均勻，靜置分層。吸取 2 mL 上層正己烷， 60 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，加?4 mL 0.5 mg/mL 鄰苯二甲醛 溶液和 2 mL 濃硫酸，顯色反應(yīng) 20 min，測定吸光值 （A550）并繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線；

2 結(jié)果分析

對 100 個(gè)酸菜樣本中乳酸菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，最終成 功分離鑒定 10 株菌，并對此 10 株菌定義編號為 M：姓氏 馬+H：黑龍江縮寫黑+S：酸菜+年限+編號；即 MHS1701、 MHS1702、MHS1703、MHS1704、MHS1705、MHS1706、 MHS1707、MHS1708、MHS1709、MHS1710。經(jīng)培養(yǎng)，10 株 菌菌落呈中等大小，有凸起，乳白色，濕潤，明顯溶鈣 圈，邊緣整齊，菌落呈圓形，且挑取時(shí)具有黏性。MHS1704 不發(fā)酵山梨醇，MHS1710 不水解蔗糖。 根據(jù)查閱《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，乳桿菌屬細(xì)菌可利 用的碳源有葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、糊精、七葉 苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、乳糖等 ，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果分析，初步判斷 10 株 菌均為乳酸桿菌屬。采用細(xì)菌 DNA 基因組試劑盒提取 10 株菌株基因 組 DNA，產(chǎn)物通過 PCR 擴(kuò)增，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，最終檢測電泳圖有且只有一個(gè)條帶，標(biāo)準(zhǔn) Marker 條帶為 2 000 bp，各菌株條帶在 1 000 bp 左右。菌株 DNA 提取產(chǎn)物條帶單一，且與預(yù)期目的大小一致，可 以滿足后續(xù)測序要求。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從傳統(tǒng)東北發(fā)酵酸菜中分離獲得植物乳 桿菌、棒狀乳桿菌、干酪乳桿菌及短乳桿菌共 10 株菌； 要求篩選出的乳酸菌除了具備特定的降膽固醇功能 以外，還必須具有益生菌所共有的優(yōu)良特性，試驗(yàn)表 明各菌株在 pH 值為 3.0 的環(huán)境以及 3 g/L 的膽鹽濃度 下具有一定的耐受性；各菌株膽固醇脫除率在 9 %～ 60 %之間，MHS1701、MHS1703、MHS1706 菌株的膽固 醇清除能力分別達(dá) 41 %、53 %、41 %，且 MHS1701 的 耐酸耐膽鹽能力最強(qiáng)。因此傳統(tǒng)東北酸菜可以作為降解膽固醇乳酸菌的來源庫，通過體外培養(yǎng)篩選得到的 植物乳桿菌 MHS1701 的功能特性最明顯，有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。



 

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