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乳桿菌的降膽固醇特性研究(一恒DHP-9082使用)

返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2019-11-26 09:58【

半個(gè)世紀(jì)以來,心腦血管疾病已成為威脅人類健 康的首要疾病,其死亡率已超過所有癌癥的總和。流 行病學(xué)和臨床調(diào)查表明,高膽固醇是引發(fā)該疾病的重 要因素之一,降低血清膽固醇水平,特別是低密度脂 蛋白水平,能顯著降低該疾病的發(fā)病率和死亡率。 某些乳酸菌菌株,能夠促進(jìn)胃腸道吸收,增加腸道有 益菌群,改善人體胃腸道功能,抑制腐敗菌的繁殖,提 高機(jī)體免疫力等重要生理功能。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

酸菜汁液:采自黑龍江佳木斯市農(nóng)家發(fā)酵酸菜,采 集樣品于離心管內(nèi),加入無菌甘油使終濃度為 25 %, 于-80 ℃冰箱保存。 MRS 培養(yǎng)基:北京陸橋技術(shù)股份有限公司;MRSCHOL 培養(yǎng)基:膽固醇 1.0 g,加 1 mL 吐溫-80 助溶, 加入 1 000 mL MRS 液體培養(yǎng)基中,調(diào) pH 值至 7.0。 革蘭氏染色試劑盒、乳酸菌生化鑒定試劑盒:北 京陸橋技術(shù)股份有限公司;細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑 盒、引物、TE 緩沖液、DNA Marker 、ddH2O、Mix 液:天 根生化科技有限公司;牛膽鹽、膽固醇(99 %):美國 sigma 公司;鄰苯二甲醛、氯化鈉、鹽酸、冰乙酸、正己 烷、無水乙醇、氫氧化鉀等試劑均為分析純級:國藥化 學(xué)試劑集團(tuán)。

1.2 主要設(shè)備及儀器

一恒DHP-9082 恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器有限 公司;HDL 超凈工作臺:北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;GL124-1SCN 萬分之一分析天平:賽多利斯科學(xué) 儀器(北京)有限公司;LDZX-50KB 立式壓力蒸汽滅火 器:上海申安醫(yī)療器械廠;PHS-3C 雷磁 pH 計(jì):上海精 密科學(xué)儀器有限公司;SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵: 上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;CX41RF 顯微鏡:日本奧 林巴斯公司;TP600 梯度 PCR 儀:日本 TAKARA 公司; Sigma-3K15 離心機(jī):德國 SIGMA 科技有限公司;UV2600 紫外可見分光光度計(jì):島津儀器有限公司;DYY6C 電泳儀:北六一儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的初步分離純化

將帶回的酸菜汁液解凍,以備使用。采用梯度平 板稀釋法,吸取酸菜汁液于 0.85 %理鹽水中進(jìn)行梯度 稀釋,然后涂布于含 0.5 % CaCO3 的固體 MRS 培養(yǎng)基 上,37 ℃靜置培養(yǎng) 48 h,挑選平板上有明顯透明圈的 菌落,在 MRS 平板上多次劃線純化直至菌落形態(tài)單 一,挑取單菌落到 MRS 液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng) 24 h,記 錄菌落特征,于 4 ℃冰箱存儲備用。

1.3.2 生理生化鑒定試驗(yàn)

對菌株進(jìn)行革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗(yàn)、采用 乳酸菌生化鑒定試劑盒做碳水化合物(蔗糖、甘露醇、 山梨醇、水楊苷等)發(fā)酵試驗(yàn)。

1.3.3 菌種 16S rDNA 鑒定

試驗(yàn)采用細(xì)菌基因組 DNA 試劑盒提取細(xì)菌 DNA,利 用 引 物 27F (5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3')、 1492R (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 進(jìn)行擴(kuò) 增;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR) 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 4 min;95 ℃變性 45 s,50 ℃退 火 45 s,72 ℃延伸 2 min,循環(huán) 30 次;72 ℃延伸 10 min, 4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1 %瓊脂糖電泳分析后,送交華 大基因公司進(jìn)行 16S rDNA 測序,所得序列在 NCBI 中 進(jìn)行比對,確定菌種。

1.3.4 降膽固醇乳酸菌的篩選

繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線:取 1 mL 的配制質(zhì)量濃度為 0.02、0.05、0.10、0.12、0.15、0.20 mg/mL 的 膽 固 醇 系 列 標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入 3 mL 95 %乙醇、2 mL 50 %氫氧化鉀, 旋渦振蕩混勻。于 60 ℃下恒溫水浴 10 min ,冷卻后加 入 5 mL 正己烷,旋渦振蕩萃取 1 min~2 min,加入 2 mL蒸餾水,振蕩均勻,靜置分層。吸取 2 mL 上層正己烷, 60 ℃水浴氮?dú)獯蹈?,加?4 mL 0.5 mg/mL 鄰苯二甲醛 溶液和 2 mL 濃硫酸,顯色反應(yīng) 20 min,測定吸光值 (A550)并繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線;

2 結(jié)果分析

對 100 個(gè)酸菜樣本中乳酸菌進(jìn)行分離培養(yǎng),最終成 功分離鑒定 10 株菌,并對此 10 株菌定義編號為 M:姓氏 馬+H:黑龍江縮寫黑+S:酸菜+年限+編號;即 MHS1701、 MHS1702、MHS1703、MHS1704、MHS1705、MHS1706、 MHS1707、MHS1708、MHS1709、MHS1710。經(jīng)培養(yǎng),10 株 菌菌落呈中等大小,有凸起,乳白色,濕潤,明顯溶鈣 圈,邊緣整齊,菌落呈圓形,且挑取時(shí)具有黏性。MHS1704 不發(fā)酵山梨醇,MHS1710 不水解蔗糖。 根據(jù)查閱《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》,乳桿菌屬細(xì)菌可利 用的碳源有葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、糊精、七葉 苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、乳糖等 ,結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果分析,初步判斷 10 株 菌均為乳酸桿菌屬。采用細(xì)菌 DNA 基因組試劑盒提取 10 株菌株基因 組 DNA,產(chǎn)物通過 PCR 擴(kuò)增,1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測,最終檢測電泳圖有且只有一個(gè)條帶,標(biāo)準(zhǔn) Marker 條帶為 2 000 bp,各菌株條帶在 1 000 bp 左右。菌株 DNA 提取產(chǎn)物條帶單一,且與預(yù)期目的大小一致,可 以滿足后續(xù)測序要求。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從傳統(tǒng)東北發(fā)酵酸菜中分離獲得植物乳 桿菌、棒狀乳桿菌、干酪乳桿菌及短乳桿菌共 10 株菌; 要求篩選出的乳酸菌除了具備特定的降膽固醇功能 以外,還必須具有益生菌所共有的優(yōu)良特性,試驗(yàn)表 明各菌株在 pH 值為 3.0 的環(huán)境以及 3 g/L 的膽鹽濃度 下具有一定的耐受性;各菌株膽固醇脫除率在 9 %~ 60 %之間,MHS1701、MHS1703、MHS1706 菌株的膽固 醇清除能力分別達(dá) 41 %、53 %、41 %,且 MHS1701 的 耐酸耐膽鹽能力最強(qiáng)。因此傳統(tǒng)東北酸菜可以作為降解膽固醇乳酸菌的來源庫,通過體外培養(yǎng)篩選得到的 植物乳桿菌 MHS1701 的功能特性最明顯,有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。



 


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