白念珠菌(Candidaalbicans)是一種常見的條 件致病真菌,平時定植于人體的皮膚、口 腔、胃 腸 道及陰道等部位,當機體抵抗力降低或菌群失調(diào)時, 白念珠菌會過度增殖,引起上述部位的。有 研究表明,醫(yī)院內(nèi)條件性真菌感染中78%~80%是 由該菌引起。
1 材料
1.1 藥物與菌株
①白念珠菌(Candidaalbicans) 標準株SC5314:由海軍軍醫(yī)大學藥學院姜遠英教授 惠贈。②桑黃:由安徽醫(yī)科大學藥學院李寧教授實 驗室提供。③BAEP制備:取桑黃子實體粉適量,加 8倍70%甲醇回流提?。炒?,每次2h,合并濾液,真 空回收溶劑,得濃縮物,濃縮物水分散后,依次用10 倍容積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次,真空揮 干溶劑,分別得到桑黃石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和 水4部分 提 取 物。④陽性對照藥物為氟康唑(flu- conazole,FLZ)(批號 J09M6B1):由上 海 源 葉 生 物 科技有限公司提供。
1.2 試劑 及 材 料
XTT 粉(批號 F523BA0012): 加拿大 BBI公司;熒 光 素 二 乙 酸 酯(fluoresceindi- acetate,FDA)(批號 F16551):上海翊圣科技有限公 司;25% 戊 二 醛 (批 號 0715A19)、PBS (批 號 0428A16):雷根生物技術有限公司;ALS1、HWP1 引物:上海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司;TotalRNA 提 取試 劑 (批 號 742100)、PCR 反 應 試 劑 (批 號 841200):日本 ToyoBo公司;DEPC 處理水、Zemol- yase酶(批號 SLBP5261V):金克 ?。ū?京)生 物 技 術有限公司;無水乙醇(批號 20190710JN):天津 市 大茂化學試劑廠;瓊脂糖(批號 182195):上海滬試分析儀器有限公司;TAE(批號 690674223):上海聯(lián) 邁生物工程有限公司;RPMI1640(批號 2023235): 美 國 Life technologies;沙 氏 培 養(yǎng) 基 (批 號 20190425):青島高科技海博生物科技有限公司。
1.3 實驗儀器
電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科技有限公司;血細胞計數(shù)板:上海求精生化試劑儀器有限 公司;CKX41-32 型 倒 置 顯 微 鏡:日 本 Olympus公 司;DMI60000B倒置熒 光 顯 微 鏡:德國徠卡光學儀 器公司;Regulus8100冷場發(fā)射式掃描電鏡:日本日 立公司;K3 型 酶 標 儀:賽 默 飛 世 爾 科 技 公 司;ABI 7500熒光定量 PCR儀:美國應用生物系統(tǒng)公司。
2 方法
2.1 菌液配制
按方法配制菌液。從4℃ 保存的沙氏瓊脂平板上挑取白念珠 菌 單 菌 落,接種 至液體沙氏培養(yǎng)液,37℃恒溫過夜培養(yǎng),血細胞計數(shù)板 計數(shù),RPMI1640(pH7.0)培養(yǎng)液稀釋集落形成單位 (colonyformingunit,CFU)至2×106/mL,備用。
2.2 BAEP 對白 念 珠 菌 的 最 低 抑 菌
濃 度(minimal inhibitoryconcentration,MIC)及抑 制50%生物 膜 的 最 低 抑 制 濃 度(sessileminimalinhibitoryconcentra- tion,SMIC50)的測定 按照方法,取100μL 菌液(CFU2×103/mL)與100μL終濃度分別為32、 64、128、256、512、1024μg/mLBAEP 及0.5、1、2 μg/mLFLZ于96孔板中 混 合,另 設 不 含 藥 物 的 陰 性對照孔,于37 ℃培養(yǎng)48h后,以肉眼觀察不到菌 落的最低藥物稀釋度為 MIC,實驗平行重復3次。 取 CFU 為2×106/mL 的菌 液100μL,與100 μL 終 濃 度 分 別 為 32、64、128、256、512、1 024 μg/mLBAEP及64、128、256μg/mLFLZ于96孔 板中混合,另設不含藥物的陰性對照孔,37 ℃培養(yǎng) 24h后,每孔中加入50μLXTT-維生 素 K3 溶液, 避光孵育2h。使用多功能酶標儀檢測492nm 處 各孔的吸光度(opticaldensity,OD)值。與空 白 組 比較,以 OD 值 降 低 50% 的 藥 物 濃 度 為 SMIC50。 SMIC50的測定實驗獨立重復3次。
2.3 固體培養(yǎng)基上觀察
BAEP對白念珠菌菌落形 態(tài)的影響 按方法配制沙氏固體培養(yǎng)基,加 入終濃度為256、512、1024μg/mL 的 BAEP,另設 不含藥物的空白對照組。用倍比稀釋法將白念珠菌 懸液中 CFU 稀釋至20/mL,取100μL于固體培養(yǎng) 基上,用稀釋 涂 布 法 涂 布 均 勻。37 ℃培養(yǎng)6d后, 以數(shù)碼相機拍攝菌落形態(tài)。
2.4 倒置顯微鏡下觀察白念珠菌酵母生物膜形
態(tài) 取 CFU 為2×106/mL 的菌液1mL,與1mL 終濃度分別 為256、512、1024μg/mLBAEP 及64μg/mLFLZ于6孔板中混合,另設不含藥物的陰性 對照孔,37 ℃培養(yǎng)24h后,以倒置顯微鏡拍攝生物 膜形態(tài)。
2.5 熒光顯微鏡下觀察白念珠菌生物膜活性
取 CFU 為2×106/mL的菌 液1mL,與1mL 終濃 度 分別為256、512、1024μg/mLBAEP及64μg/mL FLZ于 6 孔板 中 混 合,另設不含藥物的陰性對照 孔,37 ℃培養(yǎng)24h后,吸棄 上 清 液,之 后 加 入 100 μg/mL的 FDA 熒光 染 料 溶 液,避 光37 ℃染色30 min,以熒光顯微鏡拍攝生物膜形態(tài)。
2.6 掃描電鏡下觀察白念珠菌生物膜形態(tài)結構
取 CFU 為 2×106/mL 菌液2mL 與2mL 終濃 度 分 別為 256、512、1024μg/mL BAEP 及 64μg/mL FLZ混合 置 于 6 孔 板,另設不含藥物的陰性對照 孔,分別放入 經(jīng) 高 溫 滅 菌 處 理 的 硅 橡 膠 導 管,恒 溫 37 ℃培養(yǎng)24h后,將導管取出,置2.5%戊二醛中, 避光 4 ℃ 放 置 2h,依 次 置 于 35%、50%、75%、 95%、100%乙醇逐級脫水各10min,經(jīng)室溫過夜干 燥后,經(jīng) HVS-GB 型真空蒸鍍儀噴金,用 掃 描 電 鏡 觀察拍照。
3 結果
3.1 BAEP 對 白 念 珠 菌 SC5314 的 MIC 和 SMIC50 BAEP對白念珠菌菌落吸光度有明顯影響
并且隨BAEP濃度升高,白念珠菌菌落 OD明顯 降低;BAEP 對 白 念 珠 菌 SC5314 的 MIC 是1024 μg/mL,1024μg/mLBAEP 對白念 珠 菌 生 物 膜 的 抑制率可達60%以上,128、256、512μg/mLBAEP 抑制生物膜效果明顯。
3.2 BAEP對白念珠菌在固體培 養(yǎng) 基 上 菌 落 形 態(tài) 的影響
觀察固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)發(fā)現(xiàn),空白對 照組菌落 出 現(xiàn) 大 量 褶 皺,邊 緣 不 光 滑,256μg/mL BAEP組出現(xiàn)大量褶皺,邊緣不光滑,邊緣不光滑程 度小于空白對照組;512μg/mLBAEP組表面出現(xiàn) 少量褶皺,邊緣 略 光 滑,1024μg/mL 組表 面 光 滑, 邊緣光滑。
3.3 倒置顯微鏡下 BAEP對白念珠菌生物膜形態(tài)的影響
倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn),空白對照組出現(xiàn)大量 菌絲,FLZ 組未發(fā)現(xiàn)明顯菌絲,256μg/mLBAEP 組菌 絲 數(shù) 量 較 陰 性 對 照 組 有 所 減 少,512μg/mL BAEP組更 進 一 步 減 少,1024μg/mLBAEP 組不 僅菌絲數(shù)量明顯減少,且長度也明顯縮短。
3.4 熒光 顯 微 鏡 下 BAEP對 白 念 珠 菌 生 物 膜 活 性 的 影 響
經(jīng) FDA 染 色,熒 光 顯 微 鏡 下 發(fā) 現(xiàn),空 白 對 照 組 因 真 菌 活 力 最 高,熒 光 最 強;FLZ 組 熒 光 強 度 最 弱;256、512、1024μg/mLBAEP組 白 念 珠 菌 的 活 性、熒光強度隨藥物濃度遞增而減 弱。
4 討論
近年來,隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素和免疫制劑 的廣泛使用,外科介入療法的不斷增多,免疫功能低下 患者不斷增多,真菌尤其是深部真菌感染的發(fā)生率日 漸增高,其中以白念珠菌的感染最為常見。
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