白念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）是一種常見的條 件致病真菌，平時定植于人體的皮膚、口 腔、胃 腸 道及陰道等部位，當機體抵抗力降低或菌群失調(diào)時， 白念珠菌會過度增殖，引起上述部位的。有 研究表明，醫(yī)院內(nèi)條件性真菌感染中７８％～８０％是 由該菌引起。

１ 材料

１．１ 藥物與菌株

①白念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ） 標準株ＳＣ５３１４：由海軍軍醫(yī)大學藥學院姜遠英教授 惠贈。②桑黃：由安徽醫(yī)科大學藥學院李寧教授實 驗室提供。③ＢＡＥＰ制備：取桑黃子實體粉適量，加 ８倍７０％甲醇回流提?。炒?，每次２ｈ，合并濾液，真 空回收溶劑，得濃縮物，濃縮物水分散后，依次用１０ 倍容積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取５次，真空揮 干溶劑，分別得到桑黃石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和 水４部分 提 取 物。④陽性對照藥物為氟康唑（ｆｌｕ－ ｃｏｎａｚｏｌｅ，ＦＬＺ）（批號 Ｊ０９Ｍ６Ｂ１）：由上 海 源 葉 生 物 科技有限公司提供。

１．２ 試劑 及 材 料

ＸＴＴ 粉（批號 Ｆ５２３ＢＡ００１２）： 加拿大 ＢＢＩ公司；熒 光 素 二 乙 酸 酯（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｄｉ－ ａｃｅｔａｔｅ，ＦＤＡ）（批號 Ｆ１６５５１）：上海翊圣科技有限公 司；２５％ 戊 二 醛 （批 號 ０７１５Ａ１９）、ＰＢＳ （批 號 ０４２８Ａ１６）：雷根生物技術有限公司；ＡＬＳ１、ＨＷＰ１ 引物：上海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司；ＴｏｔａｌＲＮＡ 提 取試 劑 （批 號 ７４２１００）、ＰＣＲ 反 應 試 劑 （批 號 ８４１２００）：日本 ＴｏｙｏＢｏ公司；ＤＥＰＣ 處理水、Ｚｅｍｏｌ－ ｙａｓｅ酶（批號 ＳＬＢＰ５２６１Ｖ）：金克 ?。ū?京）生 物 技 術有限公司；無水乙醇（批號 ２０１９０７１０ＪＮ）：天津 市 大茂化學試劑廠；瓊脂糖（批號 １８２１９５）：上海滬試分析儀器有限公司；ＴＡＥ（批號 ６９０６７４２２３）：上海聯(lián) 邁生物工程有限公司；ＲＰＭＩ１６４０（批號 ２０２３２３５）： 美 國 Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；沙 氏 培 養(yǎng) 基 （批 號 ２０１９０４２５）：青島高科技海博生物科技有限公司。

１．３ 實驗儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；血細胞計數(shù)板：上海求精生化試劑儀器有限 公司；ＣＫＸ４１－３２ 型 倒 置 顯 微 鏡：日 本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公 司；ＤＭＩ６００００Ｂ倒置熒 光 顯 微 鏡：德國徠卡光學儀 器公司；Ｒｅｇｕｌｕｓ８１００冷場發(fā)射式掃描電鏡：日本日 立公司；Ｋ３ 型 酶 標 儀：賽 默 飛 世 爾 科 技 公 司；ＡＢＩ ７５００熒光定量 ＰＣＲ儀：美國應用生物系統(tǒng)公司。

２ 方法

２．１ 菌液配制

按方法配制菌液。從４℃ 保存的沙氏瓊脂平板上挑取白念珠 菌 單 菌 落，接種 至液體沙氏培養(yǎng)液，３７℃恒溫過夜培養(yǎng)，血細胞計數(shù)板 計數(shù)，ＲＰＭＩ１６４０（ｐＨ７．０）培養(yǎng)液稀釋集落形成單位 （ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ，ＣＦＵ）至２×１０６／ｍＬ，備用。

２．２ ＢＡＥＰ 對白 念 珠 菌 的 最 低 抑 菌

濃 度（ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ）及抑 制５０％生物 膜 的 最 低 抑 制 濃 度（ｓｅｓｓｉｌｅｍｉｎｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａ－ ｔｉｏｎ，ＳＭＩＣ５０）的測定 按照方法，取１００μＬ 菌液（ＣＦＵ２×１０３／ｍＬ）與１００μＬ終濃度分別為３２、 ６４、１２８、２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍＬＢＡＥＰ 及０．５、１、２ μｇ／ｍＬＦＬＺ于９６孔板中 混 合，另 設 不 含 藥 物 的 陰 性對照孔，于３７ ℃培養(yǎng)４８ｈ后，以肉眼觀察不到菌 落的最低藥物稀釋度為 ＭＩＣ，實驗平行重復３次。 取 ＣＦＵ 為２×１０６／ｍＬ 的菌 液１００μＬ，與１００ μＬ 終 濃 度 分 別 為 ３２、６４、１２８、２５６、５１２、１ ０２４ μｇ／ｍＬＢＡＥＰ及６４、１２８、２５６μｇ／ｍＬＦＬＺ于９６孔 板中混合，另設不含藥物的陰性對照孔，３７ ℃培養(yǎng) ２４ｈ后，每孔中加入５０μＬＸＴＴ－維生 素 Ｋ３ 溶液， 避光孵育２ｈ。使用多功能酶標儀檢測４９２ｎｍ 處 各孔的吸光度（ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ，ＯＤ）值。與空 白 組 比較，以 ＯＤ 值 降 低 ５０％ 的 藥 物 濃 度 為 ＳＭＩＣ５０。 ＳＭＩＣ５０的測定實驗獨立重復３次。

２．３ 固體培養(yǎng)基上觀察

ＢＡＥＰ對白念珠菌菌落形 態(tài)的影響 按方法配制沙氏固體培養(yǎng)基，加 入終濃度為２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍＬ 的 ＢＡＥＰ，另設 不含藥物的空白對照組。用倍比稀釋法將白念珠菌 懸液中 ＣＦＵ 稀釋至２０／ｍＬ，取１００μＬ于固體培養(yǎng) 基上，用稀釋 涂 布 法 涂 布 均 勻。３７ ℃培養(yǎng)６ｄ后， 以數(shù)碼相機拍攝菌落形態(tài)。

２．４ 倒置顯微鏡下觀察白念珠菌酵母生物膜形

態(tài) 取 ＣＦＵ 為２×１０６／ｍＬ 的菌液１ｍＬ，與１ｍＬ 終濃度分別 為２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍＬＢＡＥＰ 及６４μｇ／ｍＬＦＬＺ于６孔板中混合，另設不含藥物的陰性 對照孔，３７ ℃培養(yǎng)２４ｈ后，以倒置顯微鏡拍攝生物 膜形態(tài)。

２．５ 熒光顯微鏡下觀察白念珠菌生物膜活性

取 ＣＦＵ 為２×１０６／ｍＬ的菌 液１ｍＬ，與１ｍＬ 終濃 度 分別為２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍＬＢＡＥＰ及６４μｇ／ｍＬ ＦＬＺ于 ６ 孔板 中 混 合，另設不含藥物的陰性對照 孔，３７ ℃培養(yǎng)２４ｈ后，吸棄 上 清 液，之 后 加 入 １００ μｇ／ｍＬ的 ＦＤＡ 熒光 染 料 溶 液，避 光３７ ℃染色３０ ｍｉｎ，以熒光顯微鏡拍攝生物膜形態(tài)。

２．６ 掃描電鏡下觀察白念珠菌生物膜形態(tài)結構

取 ＣＦＵ 為 ２×１０６／ｍＬ 菌液２ｍＬ 與２ｍＬ 終濃 度 分 別為 ２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍＬ ＢＡＥＰ 及 ６４μｇ／ｍＬ ＦＬＺ混合 置 于 ６ 孔 板，另設不含藥物的陰性對照 孔，分別放入 經(jīng) 高 溫 滅 菌 處 理 的 硅 橡 膠 導 管，恒 溫 ３７ ℃培養(yǎng)２４ｈ后，將導管取出，置２．５％戊二醛中， 避光 ４ ℃ 放 置 ２ｈ，依 次 置 于 ３５％、５０％、７５％、 ９５％、１００％乙醇逐級脫水各１０ｍｉｎ，經(jīng)室溫過夜干 燥后，經(jīng) ＨＶＳ－ＧＢ 型真空蒸鍍儀噴金，用 掃 描 電 鏡 觀察拍照。

３ 結果

３．１ ＢＡＥＰ 對 白 念 珠 菌 ＳＣ５３１４ 的 ＭＩＣ 和 ＳＭＩＣ５０ ＢＡＥＰ對白念珠菌菌落吸光度有明顯影響

并且隨ＢＡＥＰ濃度升高，白念珠菌菌落 ＯＤ明顯 降低；ＢＡＥＰ 對 白 念 珠 菌 ＳＣ５３１４ 的 ＭＩＣ 是１０２４ μｇ／ｍＬ，１０２４μｇ／ｍＬＢＡＥＰ 對白念 珠 菌 生 物 膜 的 抑制率可達６０％以上，１２８、２５６、５１２μｇ／ｍＬＢＡＥＰ 抑制生物膜效果明顯。

３．２ ＢＡＥＰ對白念珠菌在固體培 養(yǎng) 基 上 菌 落 形 態(tài) 的影響

觀察固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)發(fā)現(xiàn)，空白對 照組菌落 出 現(xiàn) 大 量 褶 皺，邊 緣 不 光 滑，２５６μｇ／ｍＬ ＢＡＥＰ組出現(xiàn)大量褶皺，邊緣不光滑，邊緣不光滑程 度小于空白對照組；５１２μｇ／ｍＬＢＡＥＰ組表面出現(xiàn) 少量褶皺，邊緣 略 光 滑，１０２４μｇ／ｍＬ 組表 面 光 滑， 邊緣光滑。

３．３ 倒置顯微鏡下 ＢＡＥＰ對白念珠菌生物膜形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，空白對照組出現(xiàn)大量 菌絲，ＦＬＺ 組未發(fā)現(xiàn)明顯菌絲，２５６μｇ／ｍＬＢＡＥＰ 組菌 絲 數(shù) 量 較 陰 性 對 照 組 有 所 減 少，５１２μｇ／ｍＬ ＢＡＥＰ組更 進 一 步 減 少，１０２４μｇ／ｍＬＢＡＥＰ 組不 僅菌絲數(shù)量明顯減少，且長度也明顯縮短。

３．４ 熒光 顯 微 鏡 下 ＢＡＥＰ對 白 念 珠 菌 生 物 膜 活 性 的 影 響

經(jīng) ＦＤＡ 染 色，熒 光 顯 微 鏡 下 發(fā) 現(xiàn)，空 白 對 照 組 因 真 菌 活 力 最 高，熒 光 最 強；ＦＬＺ 組 熒 光 強 度 最 弱；２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍＬＢＡＥＰ組 白 念 珠 菌 的 活 性、熒光強度隨藥物濃度遞增而減 弱。

４ 討論

近年來，隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素和免疫制劑 的廣泛使用，外科介入療法的不斷增多，免疫功能低下 患者不斷增多，真菌尤其是深部真菌感染的發(fā)生率日 漸增高，其中以白念珠菌的感染最為常見。



 

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