植物干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，其分離方法是建立在傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)基礎(chǔ)上，具體步驟包括：1) 含分生組織的外植體消毒處理；2) 干細(xì)胞的誘導(dǎo)；3) 分離并收集干細(xì)胞；4) 干細(xì)胞的鑒定。目前關(guān)于植物干細(xì)胞的誘導(dǎo)和大規(guī)模培養(yǎng)等研究報(bào)道較少，植物干細(xì)胞培養(yǎng)僅見(jiàn)于形成層干細(xì)胞、莖尖干細(xì)胞及根尖干細(xì)胞培養(yǎng)。
1 植物貯藏根形成層干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
目前關(guān)于貯藏根形成層的培養(yǎng)，僅見(jiàn)于胡蘿卜、人參及當(dāng)歸。具體包括：外植體的消毒、抗褐化培養(yǎng)、滲透處理以及誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得形成層干細(xì)胞系。在實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程中滲透處理對(duì)形成層干細(xì)胞系的獲得尤為重要，所選用的滲透劑以及滲透劑的濃度至關(guān)重要，實(shí)際操作過(guò)程中 0.6 mol/L蔗糖效果最佳，使對(duì)滲透壓敏感的非形成層組織壞死，而對(duì)滲透壓不敏感的干細(xì)胞保持活性。處理后的外植體置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，一段時(shí)間后，所得細(xì)胞系即為干細(xì)胞系。滲透劑一般為蔗糖溶液，也有用 KCl、甘露醇等作為滲透劑的報(bào)道。干細(xì)胞誘導(dǎo)之初對(duì)植物激素的要求相對(duì)嚴(yán)格，有報(bào)道表明誘導(dǎo)初期用 IBA 或 IAA，而其他激素?zé)o效果，繼代培養(yǎng)基中一般添加 2,4-D 即可?；谏鲜龇椒?，人參、胡蘿卜以及當(dāng)歸細(xì)胞系均已成功培養(yǎng)，并且建立了當(dāng)歸和人參細(xì)胞的氣升式反應(yīng)器，人參形成層細(xì)胞與愈傷組織相比，倍增時(shí)間為 3−6 d，而愈傷組織的倍增時(shí)間為 28 d，生長(zhǎng)速度提高了 5−9 倍，人參皂苷的含量(Re、Rb1、Rb2 和 Rd)尤其是在野山參中達(dá)到了 3%。該細(xì)胞系提取物可以抗腫瘤、提高免疫力，并且還具有抗氧化、抑制皺紋產(chǎn)生的效果。當(dāng)歸干細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 21 d 后，鮮重增長(zhǎng)為 2.83 倍，愈傷組織為 1.67 倍，同時(shí)當(dāng)歸干細(xì)胞合成次級(jí)代謝產(chǎn)物活性較強(qiáng)，干細(xì)胞阿魏酸含量為 9.118 mg/kg，而在愈傷組織中未檢測(cè)到阿魏酸。
筆者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)進(jìn)行人參形成層干細(xì)胞的分離時(shí)有的材料自帶內(nèi)生菌，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程造成干擾，需要在實(shí)際的分離過(guò)程中選擇合適的消毒方法以及培養(yǎng)條件，一般選擇在干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入抗生素處理；另外，可能由于品種不同，形成層干細(xì)胞誘導(dǎo)的條件不同，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要針對(duì)特定的品種摸索具體的實(shí)驗(yàn)條件，才能保證成功獲得干細(xì)胞系。
2 木本及草本植物形成層干細(xì)胞的培養(yǎng)
采集的枝條置于抗壞血酸溶液中防止氧化，外植體常規(guī)消毒后，盡量去除韌皮部等非形成層組織，將含有形成層的組織切分后置于含有 IAA或 NAA 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，一段時(shí)間后形成層細(xì)胞自然分層，收集細(xì)胞繼代培養(yǎng)。利用上述方法成功獲得了銀杏及紅豆杉干細(xì)胞系，所獲得的干細(xì)胞系建立了大規(guī)模的懸浮培養(yǎng)體系，銀杏干細(xì)胞最終建立了 250 L 的氣升式反應(yīng)器，且干細(xì)胞干重達(dá)到了 11.7 g/L，其提取物可以清除自由基，具有強(qiáng)烈的抗氧化作用，在制藥、功能性食品領(lǐng)域具有較強(qiáng)的工業(yè)實(shí)用性。在紅豆杉干
細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方面，氣升式反應(yīng)器中干細(xì)胞增長(zhǎng)明顯優(yōu)于愈傷組織，3 L 生物反應(yīng)器中培養(yǎng) 4 個(gè)月后，來(lái)自針葉和胚胎的愈傷組織 (Callus) 干重分別為 3.33 g 和 5.08 g，而干細(xì)胞 (Stem cell) 干重為 3 819.44 g。并且 3 L 反應(yīng)器中，加入誘導(dǎo)子50 mg/L 殼聚糖和 100 μmol/L 茉莉酮酸甲酯，以及 0.1 mmol/L 的前體苯丙氨酸處理后的愈傷組織紫杉醇含量分別達(dá)到了 11 mg/kg 和 13 mg/kg，而干細(xì)胞中紫杉醇含量達(dá)到了 98 mg/kg，明顯高于愈傷組織中紫杉醇含量，經(jīng)過(guò)研究人員對(duì)培養(yǎng)參數(shù)的篩選和優(yōu)化，建立了 3 t 紅豆杉干細(xì)胞生物反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
除此之外草本植物干細(xì)胞也有相關(guān)報(bào)道，韓國(guó)建國(guó)大學(xué) Moon 等基于上述方法建立了長(zhǎng)春花干細(xì)胞系，結(jié)果表明，含有 1.5 mg/L NAA 和 0.5 mg/L KT的 B5 培養(yǎng)基放入生化培養(yǎng)箱中觀察，長(zhǎng)春堿含量達(dá)到最大值 (0.794 mg/g)，含有 1.5 mg/L NAA 和 1.5 mg/L KT 的 B5 培養(yǎng)基中長(zhǎng)春新堿的含量達(dá)到最大值 (0.279 mg/g)。不僅如此，韓國(guó)云火公司的 Lee 和 Jin 等已經(jīng)成功獲得了番茄和菊花以及艾蒿干細(xì)胞，并建立了氣升式生物反應(yīng)器，3 L 反應(yīng)器中，番茄干細(xì)胞的生長(zhǎng)速率達(dá)到了 6.3 倍，而愈傷組織的生長(zhǎng)速率只有 1.9 倍，在 250 L 的氣升式反應(yīng)器中干細(xì)胞的干重達(dá)到了12.6 g/L，番茄干細(xì)胞的提取物可以促進(jìn)原膠原的形成，抑制膠原分解酶的形成，起到了抑制皺紋的作用。
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